研發人員發現在許多癌症中，例如(rú)PDAC（導管胰腺癌）和(hé)MCC（默克細胞癌），STING（幹擾素基因刺激蛋白）是被沉默掉的(de)。當前，包括PD1/PDL1，CTLA-4抑制劑在內(nèi)的(de)一(yī)些腫瘤治療方法在試圖攻克侵襲性癌症（aggressive cancers），例如(rú)PDAC和(hé)MCC，但是都無法産生持續的(de)治療效果，而且還會産生耐受治療的(de)情況。處于免疫抑制狀态的(de)腫瘤一(yī)直是癌症治療的(de)難題。因此，急需探索新型治療手段來應對此類緻死性的(de)癌症。

激活腫瘤細胞內(nèi)的(de)STING信号通路可(kě)以将“冷”腫瘤微環境轉為(wèi)“熱”腫瘤微環境，也就是将腫瘤組織所處的(de)免疫抑制環境轉變為(wèi)免疫激活環境。在本研究中，我們應用mRNA脂質納米粒（LNP）向PDAC和(hé)MCC細胞中傳遞永久活性增益功能的(de)STING-R284S突變體。本文表明，STING-R284S的(de)mRNA-LNP傳遞可(kě)以探索作為(wèi)一(yī)種新的(de)治療工具，在重啓抗腫瘤免疫反應的(de)同時，克服傳統STING 激動劑的(de)毒性和(hé)限制性，這将有(yǒu)望成為(wèi)治療那些缺乏STING信号通路的(de)癌症的(de)有(yǒu)效手段。

研究發現，STING在MCC和(hé)其他幾種癌細胞中沒有(yǒu)表達，包括許多PDAC細胞系。首先分析了幾個PDAC細胞系和(hé)患者病變中的(de)STING蛋白水平（圖1）。

從細胞系分析中可(kě)以發現，與原代人真皮成纖維細胞（HDF）相比，STING蛋白在AsPC-1、PANC-1和(hé)Capan-1細胞中稀少，在MIA PaCa-2中幾乎檢測不到。相反，在所有(yǒu)受試細胞系中都能清楚地(dì)檢測到周期性GMP-AMP合成酶（cGAS）的(de)水平，cGAS是STING的(de)上遊激活劑（圖1A）。

圖1：在PDAC中STING被下調。（A） 使用指示抗體對PDAC細胞和(hé)原代HDF細胞的(de)全細胞裂解物進行(xíng)免疫印迹。GAPDH用作加載控制。（B）PDAC病變進行(xíng)STING（綠(lǜ)色）和(hé)CK19（紅(hóng)色）染色，并用DAPI複染。顯示了來自(zì)7名不同患者的(de)胰腺病變的(de)染色結果。

圖2：高(gāo)效STING獲得功能突變體的(de)鑒定。（A）穩定表達STING-WT、STING-V147L、STING-N154S、STING-V155M或STING-R284S的(de)MIA PaCa-2細胞用或不用5µg/mL dox處理(lǐ)48小時。對細胞進行(xíng)STING染色（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3染色（綠(lǜ)色）。（B） 穩定表達STING-WT、STING-V147L、STINGN-154S、STING-V155M或STING-R284S的(de)MIA PaCa-2細胞用或不用5µg/mL dox處理(lǐ)。在治療後96小時，通過滴度GLO 3D細胞活性測定測定細胞活性（ns：無顯著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

然後，研究着手建立一(yī)種新的(de)方法，利用STING獲得功能的(de)基因突變，在STING沉默的(de)癌症中重新激活STING信号通路。為(wèi)了篩選這些STING獲得功能突變體抑制腫瘤增殖的(de)能力，構建了穩定表達強力黴素（dox）誘導的(de)野生型（WT）STING的(de)MIA PaCa-2細胞或者是一(yī)個毒刺突變體。STING-R284S突變體在MIA PaCa-2細胞中的(de)表達顯著增加早期細胞死亡标記物切割caspase-3的(de)表達（圖2A），并抑制細胞增殖，可(kě)能通過增加經曆細胞死亡的(de)細胞數量（圖2B）。相反，STINGWT和(hé)其他STING攻能獲得突變體的(de)表達并沒有(yǒu)誘導這種效應。值得注意的(de)是，所有(yǒu)功能突變體的(de)STING增益顯示出比WT STING更低(dī)的(de)信号（圖2A）。

dox處理(lǐ)可(kě)有(yǒu)效誘導兩種穩定細胞系中的(de)表達（圖3A-B、圖S1A-B）。與STING-WT相比，dox誘導的(de)STING-R284S刺激STING下遊抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)表達，如(rú)CCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFNb和(hé)TNF（圖a3C、圖S1C）。此外，與未誘導的(de)細胞和(hé)表達dox誘導的(de)STING-WT的(de)細胞相比，STINGR-284S的(de)表達增加了切割的(de)caspase-3的(de)水平（圖3A、圖S1A），并顯著抑制了這些癌細胞的(de)增殖（圖3D、圖S1D）。

圖S1：dox誘導的(de)STING-R284S的(de)異位表達刺激PDAC細胞中關鍵的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生和(hé)癌細胞死亡。（A-C）穩定表達STING-WT或STING-R284S的(de)BxPC-3細胞用或不用5µg/mL dox處理(lǐ)24小時。（A）對細胞進行(xíng)STING染色（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3染色（綠(lǜ)色）。（B） 通過RT-qPCR證實STING-WT和(hé)STING-R284S的(de)表達。（C） 通過RT-qPCR測量所示基因的(de)mRNA水平，并将其标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平。未經處理(lǐ)的(de)STINGWT細胞的(de)值設置為(wèi)1。（D） 穩定表達STING-WT或STING-R284S的(de)BxPC-3細胞用或不用5µg/mL Dox處理(lǐ)。在治療後72小時，通過滴度GLO 3D細胞活力測定測定細胞活力。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

病毒載體不能用來攜帶“熱”STINGR284突變體，因為(wèi)STING信号通路的(de)激活阻止了許多病毒衍生載體的(de)包裝。

另一(yī)方面，mRNA-LNP已成為(wèi)在癌細胞中傳遞基因表達的(de)有(yǒu)力工具，也是強輔助性T細胞1（Th1）偏向的(de)佐劑。作為(wèi)測試這一(yī)策略的(de)第一(yī)步，我們生成了編碼STING-R284S和(hé)STING-WT的(de)mRNAs，并将它們轉染到PDAC細胞中。與模拟轉染細胞相比，在STING-WT和(hé)STING-R284S-mRNA轉染的(de)PDAC細胞中檢測到強烈的(de)STING表達（圖4A-B、圖S2A-B）。

然而，隻有(yǒu)STING-R284S-mRNA而不是STING-WT-mRNA刺激抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生，如(rú)bCCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFN和(hé)TNF（圖4C、圖S2C）。此外，與STING-WT-mRNA不同，STING-R284S-mRNA的(de)轉染顯著提高(gāo)了切割的(de)caspase-3水平，并顯著降低(dī)了癌細胞的(de)增殖率（圖4A、4D、S2A、S2D）。這些結果表明，轉染STING-R284S-mRNA可(kě)以特異性地(dì)刺激STING信号通路，産生必需的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)并殺死癌細胞。

圖4：轉染STINGR-284S-mRNA可(kě)激活重要的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生并觸發PDAC細胞死亡。（A-C）用0.5µg STING-WT或STING-R284S-mRNA轉染10e4 MIA PaCa-2細胞。轉染後15小時，對細胞進行(xíng)STING（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3（綠(lǜ)色）染色（A），通過RT-qPCR（B）确認STING-WT和(hé)STING-R284S的(de)表達，并檢測STING-WT和(hé)STING-R284S的(de)mRNA水平所示基因通過RT-qPCR進行(xíng)測量，并标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平（C）。未處理(lǐ)細胞（模拟）的(de)值設置為(wèi)1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA轉染0.5x10e4 MIA PaCa-2細胞。轉染後15小時，通過滴度GLO 3D細胞活力測定測定細胞活力。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

圖S2：轉染STING-R284S-mRNA可(kě)激活重要的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生并觸發PDAC細胞死亡。（A-C）BxPC-3細胞轉染，0.5µg STING-WT或STING-R284S-mRNA。轉染後15小時，對細胞進行(xíng)STING（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3（綠(lǜ)色）（A）、STINGWT和(hé)STING-R284S染色，通過RT-qPCR（B）确認表達，通過RT-qPCR測量所示基因的(de)mRNA水平，并将其标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平（C）。 未處理(lǐ)細胞（模拟）的(de)值設置為(wèi)1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S- mRNA轉染BxPC-3細胞。轉染後15小時，細胞活力為(wèi)通過滴度GLO 3D細胞活力測定進行(xíng)測定。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

為(wèi)了進一(yī)步開發一(yī)種治療方法，我們測試了LNP是否可(kě)以将STINGR-284S -mRNA傳遞到癌細胞中。然而，我們沒有(yǒu)觀察到STING-WT和(hé)STING-R284S在分别用mRNA LNP處理(lǐ)的(de)MIA PaCa-2和(hé)BxPC-3細胞中的(de)顯著表達（圖5A和(hé)S3A，第2、5行(xíng)）。我們測試了将STING-WT或STING-R284S -mRNA -LNP與APOE4混合是否能夠促進mRNA向PDAC細胞的(de)傳遞。我們發現，APOE4以劑量依賴性的(de)方式強烈刺激mRNA LNP向PDAC細胞的(de)傳遞（圖5A、圖S3A）。與未經處理(lǐ)的(de)細胞相比，在用mRNA LNP和(hé)APOE4組合處理(lǐ)的(de)細胞中，通過RT-PCR檢測到更高(gāo)水平的(de)STING-WT和(hé)STINGR-284S -mRNA（圖5B，圖S3B）。與僅使用STING-WT -mRNA的(de)治療相比，STING-R284S -mRNA LNP和(hé)APOE4的(de)聯合治療也顯著增強了關鍵抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)表達，如(rú)CCL5、CXCL10、IL29、IL6和(hé)TNF（圖5C、圖S3C）。

此外，LNP遞送的(de)STING-R284S -mRNA不僅誘導PDAC細胞産生裂解的(de)caspase-3，而且還顯著抑制這些細胞的(de)增殖（圖5A、5D、S3A、S3D）。重要的(de)是，相同的(de)治療沒有(yǒu)抑制CD8+T細胞的(de)增殖（圖S3E）。

圖5：由mRNA LNP傳遞的(de)STING-R284S激活必需的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生并殺死PDAC細胞。（A） 用1µg STING-WT或STING-R284S- mRNA LNP處理(lǐ)2x10e4 MIA PaCa-2細胞，将其與指定濃度的(de)重組人APOE4蛋白預混合。轉染後16小時，對細胞進行(xíng)STING染色（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3染色（綠(lǜ)色）。（B-C）10e4 MIA PaCa-2，如(rú)（A）所示，使用10µg/ml人APOE4蛋白處理(lǐ)細胞。轉染後16小時，通過RT-qPCR（B）确認STINGWT和(hé)STINGR284S的(de)表達，并通過RT-qPCR測量所示基因的(de)mRNA水平，并将其标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平（C）。未處理(lǐ)細胞（模拟）的(de)值設置為(wèi)1。（D） 0.5x10e4 MIA-PaCa-2細胞按（B）處理(lǐ)。轉染後16小時，通過滴度GLO 3D細胞活力測定測定細胞活力。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

圖S3：由mRNA LNP傳遞的(de)STINGR284S激活必需的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生并殺死PDAC細胞。（A） 10e4 BxPC-3細胞用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA LNP，與指定濃度的(de)重組人APOE4蛋白預混合。轉染後16h，細胞對STING（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3（綠(lǜ)色）進行(xíng)染色。（B-C）用1µg STING-WT或STING-R284S- mRNA- LNP處理(lǐ)10e4 BxPC-3細胞，這些LNP與10µg/ml人APOE4蛋白預混合。轉染後16h，通過RT-qPCR（B）證實STING-WT和(hé)STING-R284S的(de)表達，并且所示基因通過RT-qPCR進行(xíng)測量，并标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平（C）。未處理(lǐ)細胞（模拟）的(de)值設置為(wèi)1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP處理(lǐ)0.5x10e4 BxPC-3細胞，其與10µg/ml APOE4蛋白。轉染後16h，通過滴度GLO 3D細胞活力測定測定細胞活力。（E） 10e4 CD8+T細胞用1µg STING-WT或STING-R284S mRNA LNP處理(lǐ)，其與10µg/ml APOE4蛋白預混合。轉染後16h，通過滴度GLO 3D細胞活力測定測定細胞活力。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

我們之前的(de)研究表明，STING在MCPyV+MCC細胞系中受到特異性抑制。通過分析已發表的(de)RNA序列數據，我們發現在MCPyV-MCC細胞系UISO中表達，在所有(yǒu)六種經典MCPyV+MCC細胞系中幾乎檢測不到STING RNA表達水平：MKL-1、MKL-2、MS-1、WaGa、PeTa和(hé)BroLi（圖S4A）。RNA-seq數據還表明，與其他MCPyV+MCC細胞系相比，PeTa細胞中STING RNA的(de)表達略高(gāo)（圖S4A）。然而，Western blot分析顯示，與MKL-1細胞類似，PeTa細胞中的(de)STING蛋白表達完全不易察覺（圖S4B）。因此，這項研究證實，在我們檢測的(de)所有(yǒu)經典MCPyV+MCC細胞系中，STING表達均受到抑制。

圖S4：STING在經典的(de)MCPyV+MCC細胞系中沉默。（A） 根據公布的(de)RNA-seq數據計算MKL-1、MKL-2、MS-1、WaGa、PeTa、BroLi和(hé)UISO細胞中STING的(de)mRNA水平（HTseq計數）[87]。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001），（B） 使用指定抗體對PeTa、MS-1、UISO、MCC13和(hé)原代HDF細胞的(de)全細胞裂解物進行(xíng)免疫印迹。GAPDH用作加載控制。

在PDAC細胞中觀察到的(de)STING-R284S-mRNA-LNP的(de)抗腫瘤活性的(de)鼓舞下，我們測試了我們的(de)LNP方法是否可(kě)以用于刺激MCC細胞也有(yǒu)同樣的(de)陽性反應。我們首先使用螢火蟲熒光素酶mRNA LNP優化MCC細胞的(de)mRNA LNP輸送條件。我們确定10 ug/ml的(de)人載脂蛋白E4也是将mRNA LNP導入MCC細胞的(de)理(lǐ)想濃度（圖S5）。

與未經處理(lǐ)的(de)MKL-1和(hé)MS-1 MCC細胞相比，STING-WT和(hé)STING-R284S- mRNA- LNP處理(lǐ)的(de)細胞中均檢測到強烈的(de)STING表達（圖6A-B、S6A-B）。然而，隻有(yǒu)STING-R284S-mRNA-LNP的(de)輸送，而不是STING-WT-mRNA-LNP的(de)輸送，刺激關鍵抗腫瘤細胞因子(zǐ)CCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFN和(hé)TNF的(de)b表達（圖6C、S6C）。與STING-WT相比mRNA-LNP，用STING-R284S-mRNA-LNP處理(lǐ)MCC細胞，也提高(gāo)了切割的(de)caspase-3水平，并大大抑制了細胞增殖（圖6A、6D、S6A、S6D）。這些結果表明，STING-R284S-mRNA-LNP也能誘導受試MCC細胞系的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)表達和(hé)細胞死亡。

圖6：STINGR-284S-mRNA-LNP可(kě)觸發MCC細胞中重要的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生和(hé)細胞死亡。（A） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP處理(lǐ)10e4 MKL-1細胞，将其與指定濃度的(de)重組人APOE4蛋白預混合。轉染後16h，對細胞進行(xíng)STING染色（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3染色（綠(lǜ)色）。（B-C）10e4 MKL-1細胞被處理(lǐ)為(wèi)在（A）中，使用10µg/ml人APOE4蛋白。轉染後16小時，通過RT-qPCR（B）确認STING-WT和(hé)STING-R284S的(de)表達，并通過RT-qPCR測量所示基因的(de)mRNA水平，并将其标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平（C）。未處理(lǐ)細胞（模拟）的(de)值設置為(wèi)1。（D） 0.5x10e4 MKL-1電池，在轉染後40小時，通過滴度GLO 3D細胞活力測定測定細胞活力。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

圖S6：STING-R284S-mRNA-LNP可(kě)觸發MCC細胞中重要的(de)抗腫瘤細胞因子(zǐ)的(de)産生和(hé)細胞死亡。（A） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP處理(lǐ)10e4 MS-1細胞，将其與指定濃度的(de)重組人APOE4蛋白預混合。轉染後16h，對細胞進行(xíng)STING染色（紅(hóng)色）和(hé)切割的(de)Caspase-3染色（綠(lǜ)色）。（B-C）10e4 MS-1細胞用1µg STINGWT或STING-R284S-mRNA-LNP，與10µg/ml人APOE4蛋白預混合。轉染後16h，STING-WT和(hé)STING-R284S表達增加通過RT-qPCR确認（B），并通過RT-qPCR測量所示基因的(de)mRNA水平，并将其标準化為(wèi)GAPDH mRNA水平（C）。未處理(lǐ)細胞（模拟）的(de)值設置為(wèi)1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP處理(lǐ)0.5x10e4 MS-1細胞，并在0小時和(hé)24小時與10µg/ml APOE4蛋白預混合。轉染後40h，通過滴度測定細胞活力-GLO 3D細胞活性測定。誤差條代表三個獨立實驗的(de)SEM。（ns：不顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

綜上所述，我們證明STINGR-284S-mRNA-LNP強烈激活癌細胞中的(de)STING信号通路，從而産生關鍵的(de)抗腫瘤藥物細胞因子(zǐ)和(hé)癌細胞死亡。

為(wèi)了克服傳統的(de)STING激動劑在STING沉默的(de)癌症中不起作用的(de)局限性，我們探索了在STING沉默的(de)免疫“冷”PDAC中引入天然存在的(de)組成性活性獲得功能STING突變體以重新激活抗腫瘤免疫的(de)想法。

結果表明，STINGR-284S -mRNA -LNP可(kě)以克服傳統STING激動劑的(de)毒性和(hé)局限性，因此可(kě)以作為(wèi)一(yī)種新的(de)治療方法，用于治療一(yī)系列對當前治療無效的(de)STING缺陷型癌症。