在斑點雜交中，要檢測到的(de)生物分子(zǐ)不是首先通過電泳分離(lí)出來的(de)，相反，将含有(yǒu)被檢測分子(zǐ)的(de)混合物直接點在膜上，烘烤固定。然後與m6A或Ac4C抗體(Western blot)雜交後檢測，步驟如(rú)下：
（1）交聯：在65℃下5分鍾,使mRNA變性以破壞RNA中的(de)二級結構。變性後立即在冰上冷卻，以防止mRNA的(de)二級結構重新形成。将2 μl的(de)mRNA直接滴加到Immobilon-Ny+尼龍卷膜上，在紫外線交聯劑中進行(xíng)交聯。輕輕振蕩5分鍾，洗滌未結合的(de)mRNA。
（2）封閉：在室溫下溫和(hé)搖動，将膜在10 ml封閉緩沖液（5%脫脂奶粉）中孵育1小時。
（3）一(yī)抗孵育：将膜置于5ml抗體稀釋緩沖液（1:250稀釋; 2 μg/ml）中，于4℃溫和(hé)搖動過夜孵育膜。
（4）清洗：于洗滌緩沖液中輕輕洗滌3此，每次5分鍾。
（5）二抗孵育：将膜置于5ml Goat anti rabbit IgG-HRP（1：10,000稀釋; 20 ng/ml）二抗稀釋緩沖液中，在室溫下溫和(hé)搖動孵育膜1小時。
（6）清洗：于洗滌緩沖液中輕輕洗滌3此，每次10分鍾。
（7）在室溫下在黑暗中将3 ml Western Blotting底物孵育5分鍾。于天能全自(zì)動化學(xué)發光圖像分析系統記錄斑點印迹結果。
【實驗服務流程】
