mRNA分子(zǐ)由于疫苗的(de)關系為(wèi)大衆所認識，但是很多人卻不知道(dào)mRNA疫苗的(de)幕後功臣，甚至可(kě)以說是整個機(jī)理(lǐ)的(de)關鍵所在，是将mRNA封裝并且安全有(yǒu)效地(dì)送進機(jī)體細胞的(de)脂質納米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）。
脂質納米顆粒 (LNP) 是臨床上最先進的(de)非病毒基因輸送系統。脂質納米顆粒能夠克服阻撓基因藥物研發和(hé)應用的(de)一(yī)大障礙，安全而有(yǒu)效地(dì)輸送核酸。基因藥物有(yǒu)許多不同的(de)應用領域，例如(rú)基因編輯、疫苗的(de)快速研發、罕見遺傳病和(hé)無成藥性疾病的(de)腫瘤免疫治療，等等；所有(yǒu)這些應用領域通常都會受到核酸輸送效率低(dī)下的(de)妨礙。相較于此前的(de)脂質核酸輸送系統，脂質納米顆粒具有(yǒu)多項優勢，包括：
• 核酸包封率高(gāo)并且能夠有(yǒu)效轉染
• 組織穿透性增強，有(yǒu)利于輸送治療劑
• 細胞毒性和(hé)免疫原性低(dī)
上述特性使脂質納米顆粒成為(wèi)出色的(de)核酸輸送候選物。
從技術上來講，核酸藥物的(de)研發主要有(yǒu)三個壁壘：第一(yī)個是原料端，包括mRNA原料序列的(de)篩選和(hé)修飾；第二個是遞送系統；第三個是整個藥物的(de)生産工藝。目前采用微流控技術産生脂質納米顆粒（LNP）， 将mRNA包裹在LNP 納米顆粒中，再進入人體, 是FDA唯一(yī)批準上市(shì)的(de)mRNA傳遞技術，并且已經在世界各地(dì)注射上億劑的(de)mRNA新冠疫苗中采用，其技術的(de)安全性和(hé)有(yǒu)效性已經在這次全球的(de)新冠疫情中得到驗證。
君禮生物參照Moderna和(hé)BioNtech的(de)新冠疫苗配方，以MC3和(hé)SM102為(wèi)主要脂質，提供制備包載mRNA的(de)脂質納米顆粒（LNP）。
實驗原理(lǐ)
MC3和(hé)SM102是兩種可(kě)解離(lí)脂質，在酸性條件下可(kě)質子(zǐ)化形成陽離(lí)子(zǐ)脂質，通過靜電作用于帶負電的(de)mRNA結合，形成載有(yǒu)mRNA的(de)脂質納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)。在本實驗中采用微流控混合法，讓脂質溶液與和(hé)mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的(de)形成粒徑均一(yī)的(de)LNP。由于脂質溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中，因此需要透析或者超濾去(qù)除殘餘的(de)乙醇并将溶液體系置換至PBS中。
微流控技術基本原理(lǐ)：将脂質與核酸分别溶解在水相和(hé)有(yǒu)機(jī)相後，将兩相溶液注入制備系統的(de)兩條入口通道(dào)，一(yī)端是RNA的(de)水溶液，一(yī)端是脂質的(de)乙醇溶液，通過兩相的(de)快速混合，完成核酸脂質納米顆粒的(de)合成。 改變流體注入速度和(hé)比率，可(kě)以控制脂質納米顆粒的(de)粒徑大小。将各種脂質溶解在乙醇中，mRNA溶于酸性水緩沖液中，将兩相快速混合。通過稀釋乙醇相，脂質的(de)溶解度降低(dī)，在混合溶液中逐漸析出凝固并形成脂質納米粒，同時高(gāo)效包載mRNA。再經緩沖液膜包超濾或者透析除去(qù)殘留的(de)乙醇，中和(hé)緩沖液的(de)pH值。
實驗步驟
1、配制脂質-乙醇溶液
LNP 的(de)成分與分子(zǐ)量見下表： 百分比來源于前期研究，并不一(yī)定與onpattro和(hé)mRNA-1273相同。 每種成分别配置三個濃度：8 mM（約5 mg/ml）、12 mM（約7.5 mg/ml）和(hé)16 mM（約10 mg/ml） 2、計算mRNA濃度
根據N/P=6，FRR=3計算所需RNA濃度。
RNA的(de)堿基的(de)平均分子(zǐ)量為(wèi)340，每個堿基攜帶1個磷酸，因此RNA中的(de)含磷量為(wèi)3.1 nmol/μg.
計算氮磷比時僅計算主要脂質中的(de)氮原子(zǐ)數，因此每摩爾混合脂質中含有(yǒu)0.5摩爾N。
3、配制mRNA-檸檬酸緩沖液
使用超純水分别配制100 mM的(de)檸檬酸(分子(zǐ)量:210.14，稱取1.05 g)和(hé)檸檬酸鈉(分子(zǐ)量:294.10，稱取1.47 g)溶液各50 ml。
取33.0 ml檸檬酸溶液和(hé)17.0 ml檸檬酸鈉溶液，混合後加入DEPC，靜置30分鍾後高(gāo)壓滅菌去(qù)除DEPC，滅菌後使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的(de)檸檬酸緩沖液。
将mRNA測定濃度後根據脂質濃度使用檸檬酸緩沖液稀釋至所需濃度。
4、微流控混合
①裝配設備
②預沖洗管路和(hé)微混合芯片
③微流控混合制備LNP
1.分别将分别将脂質-乙醇溶液和(hé)mRNA-檸檬酸緩沖液通過0.22微米濾膜過濾。
2.将脂質-乙醇溶液吸入1 ml注射器中（根據需要，至少需要吸入0.5 ml），将mRNA-檸檬酸緩沖液吸入3 ml注射器中（至少吸入1.5 ml），并排出注射器中的(de)空氣。
3.将注射器出口和(hé)樣品導入管連接，并固定在注射泵上。
4.用戶可(kě)根據具體需要來調整注射泵的(de)流速和(hé)混合體積。推薦起始設定如(rú)下：
5.點擊運行(xíng)，觀察流出管流速穩定後（一(yī)般需要丢棄前200微升液體），用收集管收集流出的(de)液體。一(yī)般在注射結束前1-2秒停止收集，丢棄最後1-2秒流出的(de)液體（若配備自(zì)動切換前後廢的(de)裝置，則需要在軟件中設置）。
④透析（或者超濾）與儲存
1.樣品收集後，立即用30倍體積的(de)PBS将乙醇濃度稀釋到1%以下。
2.使用動态光散射儀測定LNP粒徑和(hé)均一(yī)度。
3.制備後放入透析管中加入14 ml PBS在搖床上透析，2小時後換液，直至18小時後透析結束。一(yī)般透析或者超濾後粒徑和(hé)PDI均會略微增大。
4.保存于含有(yǒu)2%蔗糖的(de)PBS，-80℃凍存。
快速納米藥物制備系統
【實驗服務流程】
