Mol Cancer成果|教您如(rú)何發外泌體10分文章(zhāng)
發布者：小編發布時間：2021-12-13 20:52
（1）受輻射的(de)垂死腫 瘤細胞釋放的(de)外泌體可(kě)動态增強腫 瘤的(de)繁殖
作者進一(yī)步探讨了外泌體對胰腺ai的(de)作用，作者在胰腺ai異種移植（PDX）小鼠模型中進行(xíng)了體內(nèi)實驗。發現輻照的(de)PDX腫 瘤能加速種群重現（圖1h）。當PDX小鼠同時用GW4869（外泌體抑 制劑）治 療時，腫 瘤的(de)種群顯着減慢（圖1h），小鼠的(de)生存時間延長(cháng)了（圖1i）。這些結果表明，垂死的(de)腫 瘤細胞來源的(de)外泌體促進了腫 瘤的(de)重新聚集。圖1：受輻射的(de)垂死腫 瘤細胞釋放的(de)外泌體可(kě)以動态增強腫 瘤的(de)繁殖
作者認為(wèi)腫 瘤再生細胞（TRC）可(kě)能是外泌體的(de)主要受體。由于目前沒有(yǒu)辦法鑒定TRC，因此作者收集了放射後存活的(de)胰腺ai細胞，并通過高(gāo)通量測序分析了ai症幹細胞相關基因的(de)表達譜。發現與未輻射的(de)對照組相比，有(yǒu)62個基因表達被上調， 值得注意的(de)是，輻射後ALDH1A1的(de)表達顯着上調（圖2a）。衆所周知，ALDH1A1是胰腺ai幹樣細胞重要的(de)标志物之一(yī)。ALDEFLOUR™實驗表明，放射後存活的(de)ai細胞和(hé)原發性胰腺腫 瘤細胞中ALDH +細胞的(de)比例顯着提高(gāo)（圖2b-c）。qPCR分析和(hé)Western印迹表明，ALDH1A1的(de)表達在受輻照的(de)胰腺ai細胞和(hé)PDX腫 瘤組織中表達上調（圖2d）。免疫組織化學(xué)（IHC）染色進一(yī)步顯示，ALDH1A1+細胞在PDX腫 瘤組織中照射後高(gāo)度富集（圖2e）。但是，GW4869顯 著抑 制了ALDH1A1+細胞的(de)積累（圖2e），這表明外泌體可(kě)能會促進ALDH1A1 +細胞的(de)存活。
（3）外泌體通過促進DNA損傷反應增強TRC的(de)存活
此外，作者還探究了外泌體是否能直接促進體外輻射存活TRC的(de)DDR。如(rú)示蹤細胞所示，輻射在ALDH1A1+和(hé)ALDH1A1-細胞中均引起DNA損傷（圖3c）。GW4869顯 著損害了ALDH1A1+細胞的(de)修複，因為(wèi)它們中的(de)大多數在放射後3天仍攜帶γH2A.X陽性竈（圖3c）。此外，來自(zì)輻射的(de)垂死腫 瘤細胞的(de)外泌體顯 著加速了γ-H2A.X和(hé)pATM的(de)衰減（圖3d）并降低(dī)了輻射細胞中DNA損傷（圖3e）。總體而言，這些結果表明，受輻射的(de)垂死的(de)腫 瘤細胞來源的(de)外泌體通過促進DDR增強了TRC的(de)存活。圖3：外泌體通過促進DDR增強TRC的(de)存活
作為(wèi)外泌體的(de)重要內(nèi)含物，作者推斷miRNAs可(kě)能在TRC的(de)存活中起重要作用。因此，作者進行(xíng)了對輻射前後的(de)腫 瘤細胞外泌體進行(xíng)了外泌體miRNA測序（本實驗君禮提供），發現在垂死的(de)腫 瘤細胞來源的(de)外泌體中，兩個重要的(de)miRNA，即miR-196b-5p和(hé)miR 194-5p顯着上調（圖4a）。前人研究表明，miR-194可(kě)能參與基因組穩定性。因此，作者将其作為(wèi)目标分子(zǐ)，通過qPCR分析驗證了miR-194-5p在外泌體中的(de)高(gāo)表達（圖4b）。同樣，miR-194-5p mimics轉染的(de)細胞在輻射後具有(yǒu)更強大的(de)集落形成能力（圖4d）。此外，當使用強力黴素處理(lǐ)時，胰腺ai細胞的(de)集落形成被顯 著抑 制。但是，如(rú)果強力黴素誘導後的(de)胰腺ai細胞暴露于輻射中，則這些細胞的(de)集落形成将顯 著增強（圖4e）。此外，miR-194-5p mimics在輻射的(de)胰腺ai細胞中顯 著促進了γH2A.X和(hé)pATM的(de)衰減（圖4f）和(hé)DNA損傷的(de)減少。這些結果表明，外泌體miR-194-5p通過促進DDR促進了TRC的(de)存活。先前的(de)研究确定HMGA2和(hé)E2F3是胰腺ai的(de)八個主要調節樞紐中的(de)兩個， 作者發現HMGA2負調控miR-194-5p的(de)表達（圖4j），并通過一(yī)系列實驗證明，HMGA2富含莖狀ALDH1A1+細胞，并且有(yǒu)助于胰腺ai的(de)進展。但是，當胰腺ai細胞暴露于10Gy輻射時，HMGA2的(de)過表達顯 著抑 制了這些細胞的(de)集落形成能力（圖4k），而敲除HMGA2則增強了細胞存活和(hé)集落形成（圖4l）。HMGA2還阻礙了輻射的(de)胰腺ai細胞中pATM和(hé)γH2A.X的(de)衰減（圖4m）和(hé)DNA損傷。總之，這些數據表明，TRC中富集的(de)HMGA2促進了幹細胞的(de)生長(cháng)和(hé)ai症進展，但潛在地(dì)損害了輻射的(de)TRC的(de)存活和(hé)恢複，而來自(zì)垂死的(de)腫 瘤細胞的(de)外泌體miR-194-5p瞬時逆轉了輻射下HMGA2的(de)作用。圖4：外泌體miR-194-5p促進受損TRC的(de)修複
如(rú)前所述，垂死的(de)腫 瘤細胞能促進報告細胞的(de)增殖，這暗示着TRCs被除了外泌體miR-194以外的(de)物質驅使加速了增殖。衆所周知，受輻射的(de)垂死腫 瘤細胞還釋放了PGE2，這是一(yī)種脂質代謝産物，被認為(wèi)是化學(xué)放療後腫 瘤重生的(de)重要介質。因此，作者通過ELISA定量了受輻射的(de)垂死胰腺ai細胞中的(de)PGE2，發現放射後24小時PGE2含量保持不變，但在48小時略有(yǒu)升高(gāo)，而在72小時顯 著增加（圖5a）。同時，發現 celecoxib（一(yī)種抑 制PGE2合成的(de)COX-2抑 制劑）以劑量依賴性方式顯 著抑 制了腫 瘤細胞的(de)繁殖（圖5e）。雖然PGE2可(kě)以加速腫 瘤細胞的(de)增殖，但是在放射後立即向腫 瘤細胞中添加PGE2會反向抑 制細胞活力（圖5f）。值得注意的(de)是，celecoxib處理(lǐ)并不會影響外泌體相關标志蛋白質的(de)表達（圖5g）。這些結果表明，輻射的(de)垂死腫 瘤細胞分泌的(de)外泌體對于腫 瘤的(de)再形成至關重要。（6）阿司匹林通過削弱垂死的(de)腫 瘤細胞的(de)分泌物來抑 制放療後的(de)腫 瘤
接着，作者又在PDX小鼠模型中測試了阿司匹林治 療的(de)效果。阿司匹林單一(yī)療法對PDX腫 瘤無治 療作用，單獨放療同樣無治 療作用（圖6h-i）。然而，阿司匹林治 療和(hé)放射療法的(de)結合顯 著抑 制了腫 瘤的(de)重新聚集并延長(cháng)了荷瘤小鼠的(de)存活時間（圖6h-i）。此外，阿司匹林損害了放療後腫 瘤組織的(de)恢複，這與GW4869的(de)作用相似。同時，阿司匹林還抑 制了放療後腫 瘤組織中ALDH1A1+ TRC的(de)富集。這些數據表明，阿司匹林可(kě)抑 制胰腺ai放療後的(de)腫 瘤再增殖。圖6：阿司匹林通過削弱垂死的(de)腫 瘤細胞的(de)分泌物來抑 制放療後的(de)腫 瘤
