鐵死亡，是一(yī)種調節細胞死亡的(de)方式，主要是鐵超載和(hé)活性氧（ROS）依賴的(de)脂質過氧化物累積引起的(de)。主要表現為(wèi)，與正常線粒體相比膜密度更緻密，體積更小，嵴減少或消失，外膜破裂。線粒體是鐵利用、分解代謝和(hé)合成代謝途徑的(de)主要細胞器，在鐵代謝、物質代謝和(hé)能量代謝中起着中心作用。線粒體脂質代謝的(de)關鍵調節因子(zǐ)(如(rú)ASCF2和(hé)CS)、鐵穩态(如(rú)鐵蛋白、mitoferrin1/2和(hé)NEET蛋白)、谷氨酰胺代謝和(hé)其他信号通路的(de)幹擾會對鐵敏感産生影響。

細胞活性檢測

1）CCK-8檢測

檢測方法：CCK-8試劑中含有(yǒu)WST–8，它在電子(zǐ)載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的(de)作用下被細胞線粒體中的(de)脫氫酶還原為(wèi)具有(yǒu)高(gāo)度水溶性的(de)黃色甲臜産物（Formazan），生成的(de)甲臜物的(de)數量與活細胞的(de)數量成正比，可(kě)采用酶聯免疫檢測儀在450nm波長(cháng)處測定其光吸收值，間接反映活細胞數量，可(kě)鑒定鐵死亡造成的(de)細胞死亡。

2）LDH法

檢測方法：細胞死亡伴随的(de)細胞膜結構破壞會導緻細胞質中的(de)內(nèi)容物釋放到培養液中, 其中包括活性較為(wèi)穩定的(de)LDH, 因此檢測LDH的(de)釋放可(kě)用于死細胞和(hé)受損細胞的(de)定量分析。

LDH的(de)相對水平通過其體外酶活力來反映, 即在LDH催化乳酸脫氫的(de)作用下, NAD+被還原生成NADH, 而NADH和(hé)四唑鹽類化合物被硫辛酰胺脫氫酶催化反應生成NAD+和(hé)紅(hóng)色甲臜, 生成的(de)紅(hóng)色甲臜在490 nm下産生吸收峰, 通過比色法可(kě)以定量乳酸脫氫酶的(de)活性, 進而測定死細胞和(hé)受損細胞的(de)數量。

鐵含量的(de)檢測

細胞鐵積累是鐵死亡的(de)典型标志之一(yī)，亞鐵離(lí)子(zǐ)積累可(kě)以特異性地(dì)增加氧化應激水平。

1）熒光探針法

檢測方法：可(kě)以使用PGSK探針，流式細胞術或共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)鐵含量的(de)細胞膜透性染料檢測細胞、組織中的(de)鐵水平，在鐵死亡的(de)細胞中，PGSK的(de)綠(lǜ)色熒光會減弱。鐵的(de)含量能夠指示鐵死亡是否發生，鐵離(lí)子(zǐ)含量與鐵死亡正相關。

含有(yǒu)氮氧化物結構的(de)熒光探針如(rú) RhoNox-1 能夠與 Fe2+ 特異反應, 從而使自(zì)身還原成能被激發成強熒光表達的(de)結構。通過對熒光強度進行(xíng)檢測, 可(kě)實現在活細胞或者冰凍組織切片上對Fe2+ 進行(xíng)半定量分析。

FerroOrange 和(hé) Mito-FerroGreen 等探針也可(kě)以用于特異性檢測不穩定Fe2+ 的(de)含量。

活性氧 (ROS) 檢測

檢測方法：細胞內(nèi)活性氧和(hé)脂質活性氧通過流式細胞術使用C11-BODIPY 熒光探針檢測，BODIPY 581/591 C-11是一(yī)種親脂染料，能積累在細胞膜內(nèi)，用 488nm和(hé)568nm激發，将檢測到530nm和(hé)590nm發射光（紅(hóng)色熒光），當染料被氧化後，發射光将從590nm遷移到510nm（綠(lǜ)色熒光），熒光由紅(hóng)色轉為(wèi)綠(lǜ)色，熒光強度與鐵死亡正相關。

鐵死亡相關誘導和(hé)調控分子(zǐ)表達的(de)檢測

（WB/qRT-PCR檢測）

1）鐵死亡相關誘導和(hé)調控分子(zǐ)蛋白表達水平的(de)檢測

免疫檢測法包括 Western blot、免疫熒光和(hé)免疫組織化學(xué)等, 可(kě)通過檢測調控鐵死亡過程多個通路中的(de)關鍵分子(zǐ)如(rú)SLC7A11（鐵死亡時降低(dī)，55kDa）、GPX4 （鐵死亡時降低(dī)，19kDa）、ALOX12（鐵死亡時升高(gāo)，73kDa）、FTH1（鐵死亡時降低(dī)，22kDa）、TFRC（鐵死亡時升高(gāo)，85kDa）、xCT（鐵死亡時降低(dī)，35kDa）等。

鐵死亡通路中的(de)其他調控蛋白如(rú) TfR1（鐵死亡時降低(dī)，89kDa） 、ALOX12（鐵死亡時升高(gāo)，73kDa）、 NRF2（鐵死亡時降低(dī)，75kDa）、 ACSL4 （鐵死亡時升高(gāo)，79kDA）的(de)表達等的(de)表達水平來表示鐵死亡的(de)發生。

2）鐵死亡相關誘導和(hé)調控分子(zǐ)基因表達水平的(de)檢測

熒光定量PCR方法可(kě)通過檢測鐵死亡關鍵分子(zǐ)的(de)基因表達水平來表征鐵死亡的(de)發生。除了那些編碼鐵死亡關鍵調控蛋白的(de)基因, 編碼前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2的(de)基因PTGS2和(hé)谷胱甘肽特異性γ-谷氨酰基環轉移酶1的(de)基因CHAC1的(de)表達水平也常常作為(wèi)鐵死亡的(de)生物标記來使用, 并廣泛應用在鐵死亡相關的(de)體內(nèi)和(hé)體外研究中。

檢測方法：檢測細胞形态，細胞發生鐵死亡時線粒體變小，膜密度增高(gāo)，嵴減少甚至消失。

▲使用透射電鏡觀察細胞發生鐵死亡的(de)形态

線粒體膜電位檢測

檢測方法：使用TMRE熒光染料檢測，TMRE能夠特異性标記有(yǒu)活性的(de)線粒體，是一(yī)種細胞膜可(kě)穿透性的(de)，正電荷的(de)，橘紅(hóng)色熒光染料，當線粒體膜電位降低(dī)時，熒光減弱，通過流式細胞儀收集TMRE陽性細胞的(de)比例。

此外，還可(kě)用JC-1熒光探針檢測，當線粒體膜電位較高(gāo)時，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，488nm激發時的(de)最大發射波長(cháng)為(wèi)590nm，可(kě)以産生紅(hóng)色熒光；當線粒體膜電位較低(dī)時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為(wèi)單體，488nm激發時最大發射波長(cháng)為(wèi)527nm，可(kě)以産生綠(lǜ)色熒光，熒光強度與鐵死亡正相關。

谷胱甘肽檢測

檢測方法：還原型谷胱甘肽（GSH）與鐵死亡負相關，氧化型谷胱甘肽（GSSG）與鐵死亡正相關，通過檢測GSH或GSSG的(de)水平，就能檢測鐵死亡。

脂質過氧化

鐵死亡相關的(de)脂質過氧化反應過程能夠産生大量的(de)脂質過氧化産物, 其中LOOHs作為(wèi)脂質過氧化反應的(de)初級産物, 會在氧化反應過程中逐漸分解成一(yī)系列複雜的(de)醛類化合物, 包括丙二醛 (malondialdehyde, MDA)、4-羟基壬烯醛 (4-hydroxynonenal, 4-HNE)、丙醛和(hé)己醛等, 這些活性醛類物質會攻擊蛋白等生物大分子(zǐ), 形成加合物引起細胞發生進一(yī)步損傷。

檢測方法：酶聯免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 是一(yī)種将抗原抗體免疫反應的(de)特異性和(hé)酶高(gāo)催化作用結合的(de)用于定量分析的(de)免疫測定技術, 能夠定量分析鐵死亡過程産生的(de) MDA、4-HNE-蛋白質配合物。蛋白質免疫印迹法 (Western blot) 和(hé)免疫染色法利用MDA、4-HNE 特異性的(de)抗體, 也可(kě)以用于檢測和(hé)定量 MDA、4-HNE 蛋白質配合物。